Tesis doctorales

RESUMEN

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una de las técnicas de biología molecular más conocidas en el ámbito del diagnóstico de patologías y detección de organismos en diferentes tipos de muestras. Esta técnica permite crear múltiples copias de una secuencia específica de ADN, realizando varios ciclos compuestos por etapas a diferentes temperaturas. De esta forma, partiendo de una cantidad reducida de muestra a analizar, se crean suficientes réplicas del fragmento de ADN de interés como para que sea analizable o detectable en detalle. Entre las aplicaciones principales de la PCR destacan la detección de enfermedades infecciosas como el VIH o el SARS-CoV-2 y la detección de mutaciones en el ADN que puedan provocar enfermedades como el cáncer, además de la detección de patógenos o trazas de alérgenos en diferentes alimentos.

Las reacciones de PCR se suelen llevar a cabo en equipos de laboratorio conocidos como termocicladores, los cuales están compuestos de un elemento calefactor que se encarga de ciclar térmicamente las muestras a analizar. Sin embargo, estos instrumentos requieren rampas de temperatura y volúmenes de muestra relativamente grandes para realizar las reacciones. Ante este problema, la irrupción de la tecnología lab-on-a-chip y la microfluídica han acelerado el desarrollo de sistemas miniaturizados para llevar a cabo diversos análisis de biología molecular de forma más eficiente.

En concreto, la microfluídica digital (DMF) ofrece las ventajas propias de los sistemas microfluídicos convencionales como tiempos de reacción más cortos, menor consumo de reactivos, reducción de contaminación de muestras y mejora de la sensibilidad y eficiencia general del sistema. Además, la DMF tiene ventajas adicionales respecto a la microfluídica convencional, entre las que se encuentran la ausencia de microcanales y bombas de propulsión de líquidos, altas velocidades de transferencia de muestras, la rápida transferencia de calor y la ausencia de volúmenes vacíos o “muertos” en los dispositivos. Esto se debe a que la tecnología DMF permite controlar volúmenes discretos de muestras de forma automatizada a lo largo de una matriz de electrodos actuadores gracias a fuerzas electroestáticas.

Con el objetivo de crear un sistema eficiente de PCR, en este trabajo se ha desarrollado una plataforma modular de microfluídica digital que permite integrar diferentes dispositivos DMF para la amplificación de ácidos nucleicos por PCR. Para ello, se han diseñado y fabricado por técnicas de microfabricación diferentes dispositivos DMF con los que, tras integrarlos en la plataforma DMF desarrollada, se han realizado diversos estudios. En primer lugar, se han desarrollado dispositivos DMF con los que se han llevado a cabo estudios del comportamiento dinámico del sistema microfluídico propuesto. Después, se han desarrollado dispositivos DMF enfocados a la realización de reacciones de PCR, con calefactores resistivos integrados, con los que se han podido llevar a cabo amplificaciones de ácidos nucleicos por PCR de forma satisfactoria y más eficiente en comparación con los sistemas de PCR convencionales, validando además el sistema DMF desarrollado con muestras reales.